Probele de țesuturi ale mumiei sub numele de „Maria” și „Vavita” au fost trimise din Peru la un laborator rus pentru cercetare. Probele furnizate de țesuturi biologice au fost studiate utilizând microscopie electronică de scanare, spectre Raman, ICPE, compoziția pământului diatomac (o substanță de pe suprafața pielii mumiei) a fost investigată. De asemenea, a fost efectuat un studiu al ADN-ului țesuturilor transferate.
pregătirea unei mostre
Probele de țesut de 500 μg au fost transferate în tuburi de plastic și dizolvate în 1 ml de tampon (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). La suspensiile rezultate, s-a adăugat sulfat de Na dodecil la 0,5%, încălzit la +80 C, iar după 10 minute, proteina K (până la 500 μg / ml) a fost plasată într-un termostat (+55 C) timp de 24 de ore.
Deproteinizarea s-a efectuat prin metoda fenolică: adăugarea de fenol în volum egal cu suspensia, apoi fenolul: cloroform (1: 1), cloroform; după fiecare adăugare, s-a efectuat agitarea constantă pe un rotor unghiular și o centrifugare la 15 mii rpm, 10 min.
La super-sedimentul obținut după a 3-a centrifugare i s-au adăugat 1/10 parte din volumul de NaCl 1 M și 2,5 volume de alcool etilic de două ori distilat și lăsat peste noapte la -30 C în eprubete conice - "Eppendorf". Centrifugarea a fost efectuată la 15 mii vol. min. în decurs de 10 minute și a primit ADN „precipitat” sub formă de precipitat maroniu. Peleta ADN a fost spălată de două ori cu 70% alcool etilic și uscată la temperatura camerei (1 h) și apoi dizolvată în tampon TE.
PCR a fost efectuat pe un cicler termic programabil "My Cycler" ("Bio = Rad") folosind oligoprimere standard sintetizate prin metoda în fază solidă la asociația "Beagler" (Sankt Petersburg). Amestecul de reacție pentru amplificare cu un volum de 25 μL a inclus: 15 nM din fiecare oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 la +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoetanol, 170 μg / 170 ml BSA și un amestec de patru dNTP de bază la o concentrație de 1,0 mM fiecare și ADN polimerază termostabilă Thermus termofilis (5 U / µl) (NPO SibEnzim). După denaturare (10 min, 94 C), s-au efectuat 35 de cicluri de amplificare pentru fiecare sistem de testare: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Pentru a controla specificitatea, au fost introduse în reacție probe de ADN cu genotipuri cunoscute pentru loci-urile studiate (sisteme markere), precum și probe de control,care conține un amestec de reactivi fără ADN. După amplificare, s-a adăugat un tampon de colorare la alicotele amestecului de reacție (7 µl) și separat prin electroforeză verticală în 6% gel de poliacrilamidă (210x150x1 mm), colorat cu bromură de etidiu și fotografiat sub lumină ultravioletă. Pentru identificarea alelelor, s-au folosit standardele alelice corespunzătoare acestor loci („scări”).
Video promotional:
Analiză ADN
Pentru studiu, am utilizat metoda analizei exome a ADN-ului uman bazat pe secvențiere cu un randament mare cu îmbogățirea prin hibridare.
Tehnica analizei exome a ADN-ului uman.
2 probe au fost analizate … Toate etapele pregătirii eșantionului înainte de PCR au fost efectuate în camere curate. Prepararea probelor, extracția ADN-ului și amplificarea fragmentelor de ADN individuale au fost efectuate în camere diferite.
Adaptoare specifice (KAPA Library Preparation Kit și SeqCap Adapter Kit; Roche) au fost legate la capetele ADN-ului fragmentat genomic (~ 5 ng), după care s-a efectuat o selecție în două etape de fragmente în intervalul 200-350bp lungime folosind AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … Fragmentele rezultate au fost amplificate cu primerii specifici pentru adaptor și hibridizați cu sonde specifice biotinilate (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) timp de 28 ore la 47 ° C. Într-o reacție, s-au combinat două probe de ADN. Hibrizii sondă-ADN biotinilați au fost izolați și purificați cu particule magnetice conjugate cu streptovidină; a fost realizată o a doua amplificare și evaluare calitativă a bibliotecii ADN rezultate (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Pentru a elimina fragmentele de amplificare off-target și dimerii adaptorului, biblioteca ADN a fost re-purificată folosind particule magnetice AMPureXP Beads (Fig. 1). Concentrația finală a bibliotecii pregătite a fost evaluată pe un instrument Quantus folosind un kit comercial QuantiFluor® dsDNA System (Promega). Biblioteca ADN-ului rezultat a fost imobilizată pe suprafața celulei de flux. Secvențializarea a fost efectuată pe platforma Illumina folosind o celulă de flux standard și MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicluri). Biblioteca ADN-ului rezultat a fost imobilizată pe suprafața celulei de flux. Secvențializarea a fost efectuată pe platforma Illumina folosind o celulă de flux standard și MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicluri). Biblioteca ADN-ului rezultat a fost imobilizată pe suprafața celulei de flux. Secvențializarea a fost efectuată pe platforma Illumina folosind o celulă de flux standard și MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicluri).
Figura: 1
Evaluarea generală a calității ADN-ului secvențiat
Pentru evaluarea inițială a calității au fost utilizate metode standard precum FastQC și programele Jellyfish și KraTER. Evaluarea calității nu a arătat probleme de calitate cu citirile ADN secvențiate pentru ambele probe. Imaginile nu sunt afișate, deoarece nu sunt informative.
Pentru primul eșantion (în continuare M, mumia mare „Maria”), s-au secvențiat citirile 113.4M, pentru al doilea eșantion (mai departe W, mumia mică „WaWita”) 22,9M au fost secvențiate.
Următorul pas a fost curățarea citirilor secvențiate din diverse secvențe tehnice care ar interfera cu analiza ulterioară. Pentru aceasta s-a folosit programul Cookiecutter. După curățare, 113,3 M (99%) citesc și 22,8 M (99%) au rămas pentru M și respectiv W.
Estimarea cantității de ADN antic și a separării sale de cele moderne
Metoda standard pentru evaluarea prezenței și cantității ADN-ului antic este estimarea cantității de nucleotide deteriorate în timp. Pentru aceasta s-a folosit programul MapDamage 2.0. MapDamage 2.0 care a arătat cantitatea de ADN antic în 30,1%, dar din moment ce MapDamage presupune că folosim o referință apropiată și nu știm exact cât de apropiate sunt ambele probe de genomul oamenilor moderni și am folosit o bibliotecă exome, această metodă nu a fost suficient. O altă metodă bună pentru evaluarea ADN-ului antic este numărul de fragmente scurte.
Filtrarea presupusului ADN antic a avut loc în trei etape. La prima etapă, am eliminat toate citirile în pereche care nu pot fi încrucișate și asamblate într-o citire nepereche cu o suprapunere. Aceste lecturi au indicat că fragmentul original care a fost secvențiat a fost mai lung de 300 bp. și cel mai probabil ADN modern. Așadar, după această etapă, 86,9% și, respectiv, 91,8% au rămas. După aceea, au fost selectate fragmente unice suprapuse, astfel încât lungimea lor a fost mai mică de 150 pb, deoarece aceasta este lungimea pe care ne-am așteptat-o pentru ADN-ul antic. După această etapă, 8,6% și 38,5% au rămas, respectiv, pentru eșantioanele M și W. Trebuie menționat că, în ciuda diferenței de procent, numărul absolut de citiri între probele M și W este foarte similar: 9,8M și 8,8M, ceea ce poate fi explicat prin faptul că conținutul ADN-ului antic din ambele probe este similar.
| Parametru | Proba M (Maria) | Proba W (Wawita) |
| Numărul de lecturi | 113.3M | 22.8M |
| Procentul de fragmente scurte <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Procentaj de fragmente scurte <150 bp (număr) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Procentul de fragmente aliniate pe genomul uman (număr) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264,551) |
| Procentul de fragmente aliniate pe genomul uman de la <150 bp scurt | 23,8% | 25,6% |
Obținerea ADN-ului similar genomului uman de referință
ADN-ul antic putativ rezultat a fost mapat la un genom uman de referință folosind o conductă standard de căutare a variantelor genomice folosind BWA, samtoole și Wcftools.
Mai mult decât atât, doar 23,8% din eșantionul M și 25,6% au fost cartografiate cu succes la genomul de referință al oamenilor moderni. În același timp, pentru ambele probe, 75% din citirile secvențiate nu au putut fi mapate pe genomul uman. Acest lucru poate fi explicat atât prin contaminare, cât și prin faptul că aceste probe sunt situate destul de departe de genomul oamenilor moderni. În același timp, merită să ținem cont că am secvențiat biblioteca exome și, prin aceasta, am redus la minimum contaminarea ADN-ului bacterian.
Analiza inițială de recunoaștere a citirilor necoapte a arătat că unele dintre ele aparțineau ADN-ului repetitiv specific ungulatelor, acest lucru se poate explica prin faptul că grăsimea llama a fost folosită în momificare.
O analiză mai detaliată necesită aproximativ trei săptămâni de calcule, deoarece soluțiile existente sunt făcute doar pentru genomii virali și bacterieni și trebuie să comparăm cu toate genomele existente, inclusiv genomele vegetale, pentru a înțelege ce specii au fost secvențiate.
Caracteristicile opțiunilor găsite
Citirile cartografiate au fost utilizate pentru a căuta variante care distinge probe de M și W de genomul uman modern, precum și pentru a evalua contaminarea cititelor din cromozomul Y uman.
Prima întrebare la care a trebuit să răspundă a fost la ce cromozomi au fost cartografiate citirile secvențiate.
Din moment ce știm că probele Mariei erau izolate de oase și mușchi, iar Vavita este numai de oase, ne așteptam la o diferență în cantitatea de mtDNA. Dar nu era mare diferență.
Numărul de citite cartografiate pe Y este un alt test pentru contaminarea de către oamenii moderni. Interesant este că în ambele probe s-a dovedit aceeași.
Statisticile pentru variantele găsite sunt prezentate mai jos:
| Parametrii | Proba M (Maria) | Proba W (Wawita) |
| Număr de opțiuni găsite | 79957 | 48941 |
| Număr de opțiuni pe Y | 534 | 541 |
| Numărul de opțiuni fiabile (peste 20 de citiri și mai mult de 30 de calitate) | 16969 | 6181 |
| Variante cu rsid cunoscut (disponibil în baza de date snip) | 5701 | 3089 |
| Opțiuni generale valabile | 92 | |
| opțiuni comune cu rsid | 49 |
După aceea, a devenit posibil să răspundem la întrebarea: sunt rude M și W? Raspunsul este nu.
Doar 49 de variante potrivite au fost găsite între M și W și 3040 diferind pentru variantele cu rsid cunoscut. Mai mult, poate că acestea sunt diferite tipuri sau subspecii ale unei persoane sau ale unei creaturi necunoscute.
Interesant este că variantele cu cromozomul Y sunt identice pentru ambele probe, ceea ce indică contaminarea de către aceeași persoană și că în ADN-ul antic al cromozomului Y, probabil nu există încă un cromozom.
Evaluarea similitudinii cu genomul uman secvențial existent din Proiectul Genomului Uman 1000
Rețineți că aceasta este doar o analiză aproximativă, deoarece pentru o analiză mai exactă, sunt necesare variante din regiunile genomului sub selecție neutră și avem date exome.
Cu toate acestea, folosind 5708 variante pentru M sau 3096 pentru S, a fost posibilă efectuarea unei variante a analizei comparativ cu datele a 1000 de genomi umani.
Rezultatul analizei PCA din imaginea de mai jos este o suprapunere a două imagini pentru M și W, calculate separat, deoarece există prea puține opțiuni comune între M și W pentru a estima distanțele dintre M și W.
Scor de asemănare.
După cum puteți vedea, nu există nicio coincidență cu niciun grup de gene, ele diferă, de asemenea, unele de altele. Însă trebuie avut în vedere faptul că am utilizat secvențe de codare în selecție și este recomandat să utilizăm variante sub selecție neutră.
Cu toate acestea, rezultatul PCA este în acord cu verificarea manuală a variantelor, ceea ce a arătat că datele sunt într-un homozigot nereferențiat, ceea ce indică din nou că imaginile sunt departe de genomul uman modern.
Concluzie
Din păcate, ne-am limitat la doar două probe, de obicei în acest tip de analiză se folosesc mai multe, cel puțin 3-10 cel puțin oarecum legate. Prin urmare, este necesar să se continue cercetarea cu un număr mare de eșantioane.
În același timp, cel mai probabil putem concluziona că probele de ADN ale Mariei și Văviței corespund ADN-ului uman, dar nu coincid cu ADN-ul disponibil la noi dintr-o bază de date de 1000 de persoane.
Autorii raportului: Baranov V. S. și Aseev M. V. (Institutul de Cercetare Științifică de Obstetrică și Ginecologie, Departamentul de Diagnostică Prenatală), Glotov A. S. și Glotov O. S. (Universitatea de Stat din Sankt Petersburg), A. S. Komissarov (Institutul de Citologie, Academia Rusă de Științe, Centrul de Bioinformatică Genetică).
Materiale furnizate de Konstantin Georgievich Korotkov (doctor în științe tehnice, profesor, Universitatea de tehnologii informaționale, mecanică și optică) și Dmitry Vladislavovich Galetsky (candidat la Științe Medicale, I. P. Pavlov Prima Universitate Medicală de Stat din Sankt Petersburg).
Pentru mai multe despre mumile Nazca, consultați eticheta: mumii Nazca.
