O echipă internațională de oameni de știință din Statele Unite, Franța și China a creat o formă de viață semi-sintetică. Deși s-au făcut deja încercări de a obține bacterii cu ADN modificat, microorganismele s-au înmulțit slab, au necesitat condiții speciale de creștere și, în cele din urmă, au scăpat de modificările introduse în ele. „Lenta.ru” vorbește despre o nouă lucrare în care cercetătorii au reușit să rezolve aceste probleme, după ce au obținut o creatură care este radical diferită de orice viață naturală de pe Pământ.
Nu cu mult timp în urmă, ADN-ul tuturor organismelor vii de pe planeta noastră consta din patru tipuri de nucleotide care conțin adenină (A) sau timină (T) sau guanină (G) sau citozină ©. Șiruri de zeci sau sute de milioane de nucleotide formează cromozomi separați. Genele găsite pe cromozomi sunt în esență secvențe nucleotidice lungi în care sunt codificate secvențele de aminoacizi ale proteinelor. Combinația a trei nucleotide consecutive (codon sau triplet) corespunde unuia dintre cei 20 de aminoacizi. Astfel, viața folosește un cod genetic din trei litere (ATG, CGC și așa mai departe) bazat pe un alfabet din patru litere (A, C, T, G).
Când o celulă a unui organism are nevoie de o proteină (polipeptidă), gena care o codifică este pornită. Acesta din urmă este atașat la o enzimă specială numită ARN polimerază, care, în timpul procesului de transcripție, începe să urmeze succesiunea nucleotidelor și să creeze o copie a acesteia sub forma unei molecule numite ARN mesager (ARNm). ARN-ul este foarte asemănător cu ADN-ul, dar în loc de timină, acesta conține uracil (U). După aceea, ARNm părăsește nucleul celulei și este direcționat către ribozomi, unde, în timpul procesului de traducere, servește ca rețetă pentru crearea lanțului de aminoacizi al proteinei.
Cercetătorii au decis să schimbe codul genetic al Escherichia coli adăugându-i două „litere” suplimentare. Faptul este că ADN-ul din organismele vii este dublu, adică este format din două lanțuri care sunt împerecheate între ele prin legături complementare. Astfel de legături se formează între baza nucleotidei A dintr-o catenă și baza nucleotei T din cealaltă (în mod similar, între C și G). De aceea, cele două noi nucleotide sintetice trebuie să fie capabile, de asemenea, să se cupleze complementar. Alegerea a căzut pe dNaM și d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Laboratoarele Rocky Mountain / NIAID / NIH
O pereche de nucleotide sintetice a fost introdusă într-o plasmidă - o moleculă de ADN circular cu dublă catenă capabilă să se înmulțească separat de restul genomului bacterian. Au înlocuit o pereche de nucleotide complementare A și T, care făceau parte din operonul lactozei - un set de gene care metabolizează zahărul lactoză și secvențele ADN necodificatoare asociate cu acestea. Nucleotidele sintetice nu au fost incluse în regiunea pe care polimeraza o copiază în ARNm.
Video promotional:
De ce oamenii de știință au decis să nu introducă nucleotide sintetice direct în genă, ci lângă ea? Faptul este că este foarte dificil să schimbi o genă în acest fel, astfel încât să rămână funcțională. La urma urmei, pentru aceasta trebuie să legați noii codoni rezultați de orice aminoacid. Pentru aceasta, la rândul său, este necesar să învățați celula să producă diferite tipuri de ARN de transport (ARNt), care poate recunoaște acești codoni.
Moleculele de ARNt îndeplinesc următoarea funcție. Ei, ca și camioanele, poartă un anumit aminoacid la un capăt, se apropie de ARNm în ribozomi și, la rândul lor, încep să se potrivească cu tripletul de nucleotide de la celălalt capăt cu codonul. Dacă se potrivesc, aminoacidul este eliminat și încorporat în proteină. Cu toate acestea, dacă nu există ARNt adecvat, proteina nu va fi sintetizată, ceea ce poate afecta negativ viabilitatea celulei. Prin urmare, prin inserarea nucleotidelor sintetice în gene, oamenii de știință ar trebui să creeze gene care codifică noi ARNt care pot recunoaște codoni artificiali și pot atașa aminoacidul corect la polipeptidă. Cu toate acestea, sarcina cercetătorilor a fost mai simplă. Ei trebuiau să se asigure că plasmida cu nucleotide sintetice se va înmulți cu succes și va fi transmisă organismelor fiice.
Plasmidele utilizate pentru a transforma Escherichia coli
Imagine: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Natură / Departamentul de chimie / The Scripps Research Institute
Această plasmidă, denumită pINF, a fost introdusă în E. coli. Cu toate acestea, pentru a o copia, este necesar ca multe nucleotide să fie prezente în interiorul celulei bacteriene. În acest scop, o altă plasmidă, pCDF-1b, a fost inserată în E. coli. Acesta conținea gena pentru diatomeul Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, care codifică proteina NTT, care transportă nucleotidele din mediul nutritiv în celulă.
Cu toate acestea, oamenii de știință s-au confruntat cu o serie de dificultăți. În primul rând, proteinele Phaeodactylum tricornutum au un efect toxic asupra celulei E. coli. Totul datorită prezenței în ele a unui fragment din secvența de aminoacizi, care are o funcție de semnalizare. Datorită ei, proteina ia poziția corectă în celula algei, după care secvența este îndepărtată. E. coli nu poate elimina acest fragment, așa că cercetătorii au ajutat-o. Au reușit să îndepărteze primii 65 de aminoacizi din NTT. Aceasta a redus semnificativ toxicitatea, deși a redus și rata de transport a nucleotidelor.
O altă problemă a fost că nucleotidele sintetice au fost reținute în plasmide pentru o lungă perioadă de timp și nu au fost înlocuite atunci când ADN-ul a fost copiat. După cum sa dovedit, siguranța lor depindea de nucleotidele care le înconjurau. Pentru a afla, oamenii de știință au analizat diferite combinații încorporate în 16 plasmide. Pentru a înțelege dacă o nucleotidă sintetică a scăpat din secvență, cercetătorii au folosit tehnologia CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Imagine: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 este un mecanism molecular care există în interiorul bacteriilor și le permite să lupte împotriva bacteriofagilor. Cu alte cuvinte, această tehnologie reprezintă imunitate împotriva infecțiilor virale. CRISPR este o bucată specială de ADN. Acestea conțin fragmente scurte de viruși ADN care odată au infectat strămoșii bacteriilor actuale, dar au fost învinși de apărarea lor internă.
Când bacteriofagul intră în bacterii, aceste fragmente sunt folosite ca șablon pentru sinteza moleculelor numite crARN. Se formează multe lanțuri diferite de ARN, care se leagă de proteina Cas9, a cărei sarcină este de a tăia ADN-ul virusului. El poate face acest lucru numai după ce ARNc găsește un fragment complementar de ADN viral.
Dacă, în loc de ARNc, se folosește o secvență de ARN complementară unui anumit fragment al plasmidei, atunci Cas9 va tăia și plasmida. Dar dacă există nucleotide sintetice în acel fragment, atunci proteina nu va funcționa. Astfel, utilizând CRISPR, este posibil să se izoleze acele plasmide care sunt rezistente la mutații nedorite. Sa dovedit că în 13 din 16 plasmide pierderea nucleotidelor sintetice a fost nesemnificativă.
Astfel, cercetătorii au reușit să creeze un organism cu modificări fundamentale în ADN, capabil să le rețină în sine la infinit.
Deși o formă de viață semisintetică are în genom doar două nucleotide nenaturale, care nu se găsesc în codoni și nu sunt implicați în codificarea aminoacizilor, este primul organism rezistent al cărui alfabet ADN este format din șase litere. În viitor, oamenii de știință vor putea cel mai probabil să utilizeze această inovație pentru a sintetiza proteinele, creând astfel un cod genetic artificial complet.
Alexandru Enikeev
